产品内容：
提取液：液体20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂一：液体20mL×1 瓶，4℃保存；
试剂二：粉剂×1 支，-20℃保存；
试剂三：液体3mL×1 瓶，4℃保存；
产品说明：
线粒体复合体Ⅲ（EC 1.10.2.2）又称CoQ-细胞色素C 还原酶，广泛存在于动物、植物、微生物和培养细胞的线粒体中，是线粒体呼吸电子传递链主路和支路的共有成分，负责把还原型CoQ 的氢传递给细胞色素C，生成还原型细胞色素C。
与氧化型细胞色素C 不同，还原型细胞色素C 在550nm 有特征光吸收，因此550nm 光吸收增加速率能够反映线粒体复合体Ⅲ酶活性。
试验中所需的仪器和试剂：
可见分光光度计、台式离心机、水浴锅、可调式移液器、1mL玻璃比色皿、研钵/匀浆器、冰和蒸馏水。
操作步骤：
一、复合体Ⅲ的提取： 
(1) 称取约0.1g组织或收集500万细胞，加入1.0 mL提取液，用匀浆器或研钵于冰上匀浆。
(2) 4 ℃ 600 g离心10min。
(3) 将上清液移至另一离心管中，4 ℃ 11000 g离心15min。
(4) 上清液即胞浆提取物，可用于测定从线粒体泄漏的复合体Ⅱ（此步可选做，可以判断线粒体提取效果）。
(5) 在沉淀中加入400μL提取液，超声波破碎（功率20％，超声5秒，间隔10秒，重复15次），用于复合体Ⅱ酶活性测定，并且用于蛋白含量测定。
 
二、测定步骤：
1. 可见分光光度计预热30min 以上，调节波长至550nm，蒸馏水调零。
2. 工作液的配制：临用前把试剂二转移到试剂一中混合溶解，用不完的试剂4℃可保存一周；
3. 操作表：在1mL玻璃比色皿中分别加入
 
试剂名称（μL）
测定管
对照管
试剂三
100
-
工作液
800
800
37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）准确孵育2min，之后分别加入
样品
100
100
蒸馏水
-
100
立即混匀，记录550nm处初始吸光值A1和 2min 后吸光值A2，分别记为A1测定、A2测定，A1对照、A2对照。计算ΔA=（A2测定-A1测定）-（A2对照-A2对照）。
 
三、复合体Ⅲ活力单位的计算：  
（1） 按样本蛋白浓度计算
单位的定义：每mg组织蛋白每分钟催化产生1 nmol 还原型细胞色素C 定义为一个酶活力单位。
复合体Ⅲ活力(U/mg prot)=[ΔA×V 反总÷（ε×d）×109]÷(Cpr×V 样) ÷T=262×ΔA÷Cpr
V 反总：反应体系总体积，0.001L；ε：细胞色素C摩尔消光系数，1.91×104 L / mol /cm；d：比色皿光径，1cm；V 样：加入样本体积，0.1 mL； T：反应时间，2 min；Cpr：样本蛋白质浓度，mg/mL。
注意事项：
1、 尽量保持比色皿内反应液温度在37℃或25℃。可以在记录初始吸光度A1后迅速将比色皿连同反应液一起放入37℃（哺乳动物）或25℃（其它物种）水浴中准确反应2分钟，之后迅速取出比色皿并擦干，记录2min